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造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSC）移植可能使遗传血液病、免疫缺陷病及恶性肿瘤等完全治愈，由于 HSC 移植存在以下不足而受限制：⑴为获得足够量移植用 HSC，必须进行大规模的骨髓抽吸或餐周血分离；⑵获得的 HSC 量有限；⑶HSC 输注后产生的成熟细胞的生物动力欠佳，移植后 1 - 3 周内并无直接治疗疗效。移植前 HSC 培养扩增，可解决这些难题。当前主要有两种：⑴细胞因子支持下筛选 CD34+ 细胞的体外扩增；⑵基质支持下的灌注培养。下面就 HSC 培养的发展、HSC 扩增方法以及展望等作一综述。
1 早期 HSC 培养及启示
（1）半固体培养体系 1966 年，Bradley 等 [1] 介绍了一种新的半固体培养方法（即集落形成法）用以培养骨髓。此法利用胶体凝胶作支托，没有细胞微环境，只能维持造血祖细胞在 1 - 2 周内形成细胞集落，不能支持 HSC 的生长或分化。即使没法加入营养物、生长因子等，培养时间也只能延长到 2 - 4 周。由半固体培养体系的期限性可推断，早期原始 HSC 不能在这样的培养体系中存活、增殖。
（2）Dexter 培养体系 Dexter 等 [2] 于 1977 年建立了骨髓液体培养体系。此培养法基础是建立一骨髓基质细胞支持层（包括成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和网状细胞等），形成二维空间结构，培养体系不单提供了营养、细胞因子，而且提供了类似于体内的细胞 - 细胞关系，使此法纤维造血 8 -12 周[3]。极限稀释法技术证明，在 Dexter 培养体系中，前造血祖细胞在培养第一周前已开始减少[4]。应用细胞免疫表型分析提示，该体系培养的骨髓 CD34+、CD38- 细胞不能更新复制[5]。早期造血细胞体外培养扩增方法的研究启示：HSC 细胞可在体外培养，但两种培养方法均没有建立适合其体外造血的微环境。寻求建立，一个合适的人 HSC 培养体系是研究的关键。
2 目前 HSC 的体外扩增方法
理想的 SHC 培养方法要求既能最大限度地扩增各阶段的造血细胞，又能维持甚至扩增 HSC。目前较为成功的人 HSC 体外扩增方法主要有两种：⑴细胞因子支持十筛选 CD34+ 细胞的体外扩增；⑵基质支持下的灌注培养。
2.1 细胞因子支持下筛选 CD34+ 细胞培养
2.1.1 HSC 的特性 HSC 没有任何形态方面的特征，也没有独特的免疫表型迄今尚无直接检测的方法。HSC 只能通过脾结节形成法检测，也可通过检测高增殖潜能集落形成单位（CFU-HPP）长期培养启动细胞（LTC-IC）反映其存在。其免疫表型特征有：CD34+、Thy-1-/ 弱 +、Lin-、CD33-、CD38-、CD45Ro-、HLA-DR-。其 Rh-123 荧光呈阴性或低强度，对 4 -HC/5-Fu 有抗性。HSC 是不均一的细胞群体，早期的造血细胞大部分处于 G0/G1 期，启动慢，但扩增持续时间长，扩增倍数高，造血细胞产量高。较成熟造血细胞启动快，短期扩增倍数高，维持时间短，产物多是成熟细胞，造血祖细胞产量少。
2.1.2 细胞因子的造血调节根据细胞因子对造血细胞不同的作用阶段将其分为：⑴特异性细胞因子：大多作用于分化后期，包括 EPo、TPo、M-CSF、G-CSF 和 IL-5；⑵无系特异性细胞因子：作用于分化状态的 HSC，包括 IL-3、GM-CSF 和 IL-4，其功能主要维持处于 G0 期之外所有 HSC 的生存、增生；⑶G0 期作用细胞因子：包括 IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF 和 SCF，维持早期 HSC 的存活或促其分化扩增：⑷抑制血细胞生成的细胞因子：包括 TNF-α、TNF-βIFN 和 MIP-1α 等，其中 INF 和 TNF-Αfq 系特异性，TGF-β 主要抑制早期血细胞生成，MIP-α 抑制原始的 HSC 的增殖[6]。
2.1.3 扩增策略 目前细胞因子支持下筛选 CD34+ 细胞体外扩增方法研究最为普遍。实验证明，筛选早期 HSC 剔除成熟的 CD34- 细胞进行扩增，可获得更好的效果[7]。单独应用一个细胞因子扩增人 HSC 效果不佳，多个因子合理组合才能获得理想的扩增效果。一般认为，生长因子合理组合应包括：⑴抑制细胞残死亡的存活因子，如 IL-1、IL- 6 和 SCF 等⑵刺激早期造血细胞增殖的因子，如 SCF、IL- 3 和 GM-CSF 等；⑶定向扩增刺激因子，如 G -CSF 和 EPO 等[9]。
Moore[10]用 delta 培养法培养骨髓 CD34+ 细胞，发现未用因子时 CFU-GM 迅速消失；而单用 SCF、IL-1、IL- 3 或 IL- 6 等因子时，14 天培养 CFU-GM 维持不变或只扩增 2 - 8 倍；用 SCF/IL- 3 联用另 3 个或 3 个以上因子组合扩增效果更好。多数人认为合适的细胞因子组合为 IL-1/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF/SCF，14-17 扩增经动员外周血（MPB）CD34+ 细胞，使 CFU-GM 增殖 66 倍 [11]，以扩增非 MPBCD34+ 细胞，使 CFU-GM 增殖 55 倍[12]。而 Bruggert 等[13] 则认为 SCF/IL-1/IL-3/IL-6/EPD 最适于外周血 CD34+ 细胞扩增，12-14 天培养，扩增 CFU-GM250 倍，CFU-Mix25 倍。而扩增脐血 CD34+、CD45RA low、CD77low 的 CFU-GM（70 倍）和 BFU-E（55 倍）的最好因子组合分别为 SCF/IL-6/PIXY/M-CSF 和 SCF/IL-6/IL-3/EPO，扩增两者的最佳组合是 SCF/IL-6/PIXY/M-CSF/G-CSF/EPO[14]。NakahataT[15]指出，早期 HSC 大部分无 IL-6R 表达，IL-6/Sil-6R 复合体激发 HSC 表达 gp130，启动 HSC 自我复制的信号传递，而 c -Kit/SCF 是 HSC 自我自制扩增的另一信号传递途径。无血清条件下，IL-6/SIL-6/SCF 孵育人脐血 CD34+ 细胞，细胞总数和造血祖细胞数随 Sil-6R 增加而明显增加，培养 14 天，
CFU-GM 扩增近 70 倍，集落中除了几个 CFU- M 和 BFU- E 外，有大量（≥60%）的 CFU-GEMM 和 CFU-Blast；有血清的情况下，培养 7 天，14 天，分别扩增 CFU-Mix60 倍和 70 倍。由此说明，细胞因子促进造血是通过与期受体结合引起信号传递而起作用的，为体外造血研究开创了新的思路。
细胞因子支持下筛选 CD34+ 细胞扩增法有以下优越性：⑴条件容易控制，产量稳定；⑵无异体基因污染。缺点是：目前还无可完全代替基质的细胞因子，单用因子不能维持体外长期造血；需不断加入因子，费用昂贵，不能大规模使用。
2.2 基质细胞支持的灌注培养
此培养方法提供 HSC 一个接近于体内的造血环境，能扩增各阶段的造血细胞，并维持甚至扩增原始 HSC，称原始 HSC 培养方法。
2.2.1 基质支持作用 此作用除了通过细胞 - 细胞接触的直接作用外，还分泌许多因子影响造血过程。骨髓基质是最常用的造血支持层来源，包括基质细胞、基质细胞分泌的胞外基质（胶原、纤维结合蛋白、层素、糖蛋白等）以及多种造血生长因子（如 GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-6、INF-α、IFN 和 TGF-β）调节 HSC 的造血动力学。用作造血支持的基质细胞除骨髓外还包括其它许多来源的细胞。基质细胞与 HSC 可以同基因或异基因、同种或异种。此外，还建立了许多转化的基质细胞系，用于造血支持。经过转化的基质细胞系具有分泌细胞因子的功能，加强造血调控。Otsukat 等 [16] 报道，在长期培养体系中，以基因工程改造的成纤维细胞为支持细胞，使之分泌 GM-CSF、G-CSF 和 IL- 3 因子，相同浓度下，这些因子对 HSC 增殖有更强的刺激作用。
直接比较基质支持培养和细胞因子支持培养的扩增效果显示，目前可能用到的任何细胞因子都无法完全代替基质细胞的支持作用。因子培养结果，原始 HSC 常常减少，而只有基质支持的培养可使原始 HSC 维持不减甚至扩增[17，18]。有实验显示，骨髓的 LTC-IC 在细胞因子支持下培养只维持 35% 的启始量，而基质细胞却能令其扩增 5 倍[16]。脐血 LTC-IC 在因子作用下培养 7 天，扩增 2 - 7 倍，培养 14 天，扩增 2 - 3 倍，而基质细胞却可达加倍的扩增效果[19]。用微孔网把 HSC 和基质隔开称基质非接触共培养，近期文献认为，HSC 与基质接触与否并不影响增殖分化[20]。相反，非接触可部分地使 HSC 与产生增殖负性细胞因子信号的隔开，减轻造血受抑。
2.2.2 造血生长因子支持作用。基质支持灌注培养常加用因子，以加强 HSC 的扩增效果。因子一方面支持基质细胞，起间接造血作用，一方面直接刺激 HSC 存活、增殖、分化。Koller 等 [18] 在生物反应系统中，加入 IL-3/IL-6/SCF 培养脐血单个核细胞（MNC），15 天培养扩增 CFU-GM11 倍、5 天 BFU-E2.5 倍、3 天 CFU-Mix5.3 倍及 5 天 LTC-IC3 个样品中 2 个扩增 3 倍。他的另一实验，基质细胞支持培养不同纯度的人骨髓 CD34+ 细胞，采用多种因子组合比较，以 IL-3/IL-6/SCF/EPO 及 IL-3/GM-CSF/SCF/EPO 扩增效果最佳，细胞、祖细胞数明显增加，而且维持 LTC-IC 不减[17]。
2.2.3 介质灌注作用 介质灌注是影响 HSC 培养的又一重要因素。介质灌注可以保证营养、细胞因子等供应，清除有造血抑制代谢产生，刺激基质细胞分泌因子 [21]。控制适当的介质灌注，显著地提高体外造血的效率。已知，体内组织细胞细胞密度为 5 ×108•ml- 1 的浆灌注为 0.1ml•kg-1•min-1，相当于细胞密度为 106•ml-1，含 20% 血清的培养介质，每天全部更换一次。Schwartz 等[22] 按 7V•W-1，3.5V•W- 1 和 1V•W- 1 换液培养低密度的骨髓 MNC，发现 3.5V•W- 1 换液效果最好，可维持造血 20 周。整个过程，细胞产量传统 Dexter 培养法的 3 倍，而且维持祖细胞稳定生产直到 18 周，在已报道文献中，造血维持时间最长。Plasson 等也发现同样结果。
2.2.4 氧浓度的影响 Koller 等认为 5% 低氧化正常 20% 氧浓度更能刺激造血，实验见 CFU-GM、BFU- E 和 CFU-GEMM 分别扩增 12 倍、3 倍和 4 倍。此外，延长祖细胞维持时间 1 - 2 周。而 Palson 等的实验则显示 20% o2 最利于体外造血，40% O2 次之，5% 及 60%O2 最差。
2.2.5 生物反应器作用 有人通过改进反应器提高 HSC 扩增效果。如 Davis 等 [26] 利用人造血毛细血管系统用猪内皮细胞支持培养骨髓 CD34+ 细胞、培养 18 天，CD34+ 细胞扩增 150 倍、CFU-GM1600 倍、CFU-Blast77 倍，效果特点显著。应用该体系，造血祖细胞及早期造血细胞均获相当高的扩增，似乎找到 HSC 扩增的真谛。
2.2.6 培养启始 HSC 纯度影响 低纯化或不纯化 MNC 灌注培养具有以下优点：⑴保存尽量多的 CD34+ 辅助细胞；⑵大量的基质细胞在培养过程中可形成支持层；⑶减少筛选过程对 HSC 破坏。Koller 等用不同纯度的 CD34+LIN- 细胞灌注培养，证明 CD34+LIN- 细胞纯度越低，扩增细胞、CFU-GM 和 LTC-IC 倍数越高，而以后两种最受影响。
2.2.7 其它 细胞接种密度和收获时机对 HSC 扩增效果有一定影响。粘附因子介导 HSC 和基质细胞的接触刺激 HSC 增殖分化，也是不可忽视的因素。
基质细胞支持下灌注培养有如下优点：⑴维持造血时间长达数月（≥5 月）；⑵可维持 LTC-IC 不减甚至扩增；⑶细胞因子应用少，费用低；⑷扩增前无太多的处理，保持 HSC 的活性，避免去除辅助细胞。缺点是条件不易控制，产物不稳定。
3 展望
由于目前对 HSC 的特性尚未透彻了解，所以 HSC 体外扩增要获得不同阶段的细胞大量增殖，同时扩增原始细胞量遇到困难。以后研究可以主要集中于以下几个方面。
3.1 HSC 增殖分化的调控基因研究 在分子水平和基因水平把握造血的的机制，指导体外 HSC 的培养，HSC 逐渐分化，丧失自我更新的能力，可有由于基因易位和重排所致。若然如此，通过基因重新复位，可使一个已经分化的细胞返祖为 HSC。在此领域研究信号传导机制，可以在关键点阻断 HSC 分化信号传导，而加强自我更新信号传导，提高 HSC 的扩增。
3.2 新的造血生长因子的发现，目前所用的造血生长因子均无法代替基质细胞的作用，说明仍存在某种未知的关键造血调控因子。致力于新的造血生长因子发现，将对改善 HSC 培养起巨大作用。
3.3 定向细胞培养 使 HSC 向某一系定向增殖是 HSC 培养的新方向。针对临床不同需要，选择性扩增红细胞、粒细胞、淋巴细胞、血小板、NK 细胞等具有广阔的应用前景。
可以相信，随着细胞生物学，分子生物学及其相关学科和技术的发展，对 HSC 了解会更加明了，HSC 的扩增会逐步完善。HSC 扩增技术的发展将为血液系统疾病、肿瘤的基础研究和临床治疗提供充足的材料和新的技术方法。
