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干细胞再生为心肌组织的研究及心肌梗死的修复带来了新的曙光。近期的研究表明，在成年人和哺乳动物心脏内，均存在原始的、未分化的干细胞，该细胞 c-kit 阳性，被命名为心脏干细胞（cardiac stem cells）。心脏干细胞在体内外被证实可分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并重构心肌组织，改善心功能。但在成年人和哺乳动物的心脏组织中，心脏干细胞数量较少，分离较为困难。经过几年来的探索，已经形成了一套较为稳定的分离方法，可用于相关领域的研究。
一、材料与方法
1．实验动物：随机选择无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级成年 SD 大鼠，体重 200~250 g，雌雄不限。
2．实验试剂及药品：免疫磁珠分选系统购自 Dynal Biotech 公司，细胞培养相关试剂购自 Hydone 公司，胶原酶及胰蛋白酶购自 Sigma-Aldrich 公司，各种抗体购自 SantaCruz 公司，其余试剂及药品均为国产分析纯产品。
3．细胞分离：主要采用两种方法分离 c-kit 阳性的心脏干细胞。
（1）免疫磁珠分选法（magnetic activated cell sorting）：分离 c-kit 阳性心脏干细胞主要操作步骤：大鼠肝素化后断颈处死，在无菌环境下迅速打开胸腔，摘除心脏及部分主动脉，将心脏套管从主动脉插入，用预冷充氧的无 ca2+、M92+ 的 Tyrode 液灌流心脏，待心脏血液去除干净后将其置于 Langendorff 灌流装置下。将 0．5 m∥L 胶原酶和 0．05 mg/L 胰酶混合消化液加入 1．angendofff 灌流装置中，保持 37℃消化约 60 min。消化完成后，将心脏剪碎，尤其是注意收集房室交界部位和心尖部的心肌组织，置于混合消化液中，于 37℃水浴锅内继续消化 10 min。用 70µg 和 40µg 的细胞收集器收集细胞悬液，去除未消化的心肌组织和部分心肌细胞。采用差速离心的方法将较大的细胞和较小的细胞分离开，并选用较小的细胞。细胞洗涤后加入兔抗鼠 c-kit 抗体（1：250），4℃下旋转孵育 1 h。第一次孵育完成后，离心重悬细胞沉淀，加入结合于磁珠的羊抗兔 IgG 抗体（1：150），4℃下旋转孵育 30 min。第二次孵育完成后，将细胞悬液连同离心管一同置于磁柱上，利用磁力分选结合磁珠的细胞。分选完成后，用含 15%胎牛血清（FBS）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20µg/L）、自血病抑制因子（LIF，10µg/L）、青霉素（105U/L）、链霉素（100 mg/L）的完全培养液重悬上述黄褐色颗粒，即为结合了磁珠的细胞（即 e-kit 阳性细胞）。
（2）组织块培养法分离 c-kit 阳性心脏干细胞：为了更好地适用于临床心肌活检的实际情况，我们另采用组织块培养法分离 c-kit 阳性心脏干细胞。SD 大鼠处死后，将心脏分为左右心房、左右心室、室间隔及心尖部，每一部分剪成 1~2mm3 大小组织块；用无 ca2+、M2+ 的 Tyrode 液洗涤组织块，将其置于 0．5 mg/L 胶原酶和 0．5 mg/L 胰酶混合消化液中 37℃下消化 10 min；弃除悬浮的细胞，用元 Ca2+Mg2+PBS 洗涤组织块；洗涤完成后，将组织块置于上述完全培养液内。每 1-2 周收集一次从组织块中迁出的细胞，共收集 10 次。收集完成后，使用免疫磁珠分选法从收集的细胞中分选 c-kit 阳性细胞。
4．细胞鉴定：按照 6 X 105/ 孔的密度将培养至第 3 代的细胞接种于置有盖玻片的 6 孔培养板中至细胞生长至 70%~80%汇合，PBS 洗涤后 4%多聚甲醛固定 10 min，再经 0．5%Triton X-100 处理 5 min，PBS 洗涤后加入一抗（兔抗鼠 c-kit 抗体，1：200），4℃孵育过夜；洗涤后加入二抗，37℃孵育 30 min；Hoechst 33258 对比染细胞核 5 min；加入抗荧光淬灭封片液封片，置于荧光显微镜下观察结果。实验中同时设立阴性对照。细胞免疫组织化学染色采用 En Vision 法，操作步骤同组织学染色法。
二、结果
免疫磁珠分选法和组织块培养法均可以稳定获得 c-kit 阳性心脏干细胞，倒置相差显微镜下观察活细胞，可见此细胞为小圆形细胞，表面结合有单个或多个磁珠。此类细胞培养 5 d 左右出现克隆性生长，并可逐渐贴壁，细胞免疫组织化学及免疫荧光染色可见原代及传代细胞均表达 c-kit。
