共计 1183 个字符，预计需要花费 3 分钟才能阅读完成。
一、实验材料与试剂
-
ROCK 抑制剂 Y-27632（二盐酸盐）
STEMCELL Technologies，#72304 -
StemFlex 培养基（含补充剂；可选添加抗生素，如 Normocin）
-
Accutase 细胞解离液
STEMCELL Technologies，#07920 -
Geltrex（用于培养器皿包被）
-
台盼蓝（Trypan Blue）（用于细胞计数）
-
细胞计数板 / Countess 计数载玻片
-
15 mL 离心管、移液枪及枪头
注：以上试剂均可从 Broad Store 或等效渠道获得。
二、实验前准备与注意事项
-
方法适用性说明
单细胞传代（Accutase）对人多能干细胞的刺激强于 EDTA 集落传代，仅在需要获得单细胞悬液时使用（如细胞计数、单细胞实验等）。 -
实验条件准备
-
将 StemFlex 培养基、ROCK 抑制剂及 Geltrex 包被的 6 孔板或 T75 瓶 提前 15 min 置于生物安全柜中回温至室温。
-
使用 70% 乙醇清洁显微镜载物台。
-
-
细胞状态要求
-
细胞融合度约 90% 时进行传代效果最佳。
-
-
体积说明
-
以下操作以 2 个 6 孔板孔 → 1 个 T75 瓶 为例，其余培养器皿按比例调整体积。
-
三、实验步骤
1. 生物安全柜准备
-
打开生物安全柜，使用 70% 乙醇全面喷洒并擦拭消毒。
2. ROCK 抑制剂培养基配置
-
按 1:1000 比例将 10 μM 的 Y-27632 加入 StemFlex 培养基中，配制 SF/RI 培养基。
-
每个细胞系准备约 28 mL SF/RI：
-
3 mL 用于终止 Accutase
-
25 mL 用于细胞接种
-
-
向标记好的 15 mL 离心管 中加入 3 mL SF/RI（每个样本一管）。
3. Accutase 消化
-
吸尽待传代孔中的培养基。
-
每孔加入 1 mL Accutase。
-
将培养板置于 37°C 培养箱孵育 5–10 min。
若需计数：在此期间，每个样本准备一个含 10 μL 台盼蓝的 EP 管。
4. 单细胞解离与收集
-
显微镜下观察细胞：
-
细胞应呈圆形、边缘发亮，轻轻晃动培养板可见细胞脱落并漂浮。
-
-
使用 P1000 移液枪轻柔吹打 5–10 次，使细胞完全从底部脱落。
-
将细胞悬液转移至对应的 15 mL 离心管 中。
-
轻轻颠倒离心管或缓慢吹打数次，确保形成均匀的单细胞悬液。
5. 细胞计数（可选）
-
取 10 μL 细胞悬液加入预先准备好的台盼蓝 EP 管中。
-
轻柔混匀 5–10 次。
-
取 10 μL 混合液加入 Countess 计数载玻片或血球计数板进行计数。
6. 离心与重悬
-
将细胞悬液 1000 rpm 离心 5 min。
-
离心期间：
-
吸除 T75 瓶中的 Geltrex
-
向每个瓶中加入 19 mL SF/RI
-
-
离心结束后，小心吸弃上清。
-
使用 6 mL SF/RI 轻柔重悬细胞，获得单细胞悬液。
7. 细胞接种与培养
-
将细胞悬液缓慢加入对应的 T75 培养瓶中。
-
前后、左右、交叉轻轻晃动培养瓶约 5 次，使细胞均匀分布。
-
将培养瓶放入培养箱后，再次轻轻晃动。
-
24 h 内避免移动培养瓶。
8. 培养基更换
-
传代后 第 2 天 ，将含 ROCK 抑制剂的 SF/RI 培养基更换为 不含 ROCK 抑制剂的常规 StemFlex 培养基。
