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一、实验材料与试剂
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Geltrex 基质胶
Gibco，A1413301 -
培养基
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StemFlex（Gibco，A3349401）
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或 mTeSR（STEMCELL Technologies，#85850）
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ROCK 抑制剂 Y-27632
STEMCELL Technologies，#72302/72304 等
（以无菌分子级水配制成 10 mM 储备液） -
DMEM/F-12 培养基
Gibco，11320033 -
Normocin 抗生素（可选）
InvivoGen，ant-nr-1 / ant-nr-2 -
37°C 水浴锅
二、实验前准备与注意事项
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包被培养板
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使用 DMEM/F-12 稀释的 Geltrex（1:100） 包被 6 孔板，每孔 1 mL。
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将包被好的培养板置于 37°C 培养箱中至少孵育 1 h。
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Geltrex 全程保持低温，避免提前凝胶化。
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Matrigel（Corning，BD354277）可作为替代包被材料。
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复苏比例建议
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每支冻存管复苏至 6 孔板的 1 个孔，除非另有说明。
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培养基准备
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配制含 ROCK 抑制剂（终浓度 10 μM） 的培养基（以下简称 RI 培养基）。
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如需抗生素，可加入 Normocin（终浓度 100 μg/mL）。
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每支冻存管需准备 8 mL RI 培养基：
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5 mL 用于复苏后稀释与离心
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3 mL 用于接种 1 个 6 孔板孔
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所有培养基需提前回温至室温，以提高细胞存活率。
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冻存保护剂说明
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冻存液（如 CryoStor CS10）含 10% DMSO，在室温下具有细胞毒性，因此需尽快稀释并离心去除。
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三、实验步骤
1. 冻存细胞解冻
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将冻存细胞保存在干冰上，直至准备复苏。
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将冻存管迅速置于 37°C 水浴 中轻轻晃动解冻，直至仅剩少量冰晶（约 1–2 min）。
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立即将冻存管转移至生物安全柜，完成剩余解冻过程。
2. 稀释与离心
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将解冻后的细胞悬液迅速转移至预先标记好的 15 mL 离心管 中（内含 5 mL RI 培养基）。
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轻柔混匀后，1000 rpm 离心 5 min 以沉淀细胞。
3. 接种准备
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离心期间：
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吸除已包被 6 孔板中的 Geltrex
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向每孔加入 3 mL 预温的 RI 培养基
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注意避免培养板长时间干燥，防止 Geltrex 失效
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建议在培养板上标注：
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细胞系名称
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传代数
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日期
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操作者姓名缩写
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使用培养基类型
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4. 细胞重悬与接种
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小心吸弃离心后的上清。
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使用 1 mL 来自培养板中的 RI 培养基 轻柔重悬细胞沉淀（推荐使用吸液枪头以减少细胞损失）。
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将细胞悬液转移至对应孔中。
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前后、左右轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。
5. 培养与换液
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将培养板放入培养箱中培养。
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复苏后第 2 天 更换为 不含 ROCK 抑制剂的常规培养基。
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换液频率：
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StemFlex：隔天换液
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mTeSR：每日换液
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mTeSR Plus 可用于隔天换液（建议仅限周末使用）
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四、补充说明与经验要点
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复苏培养基一致性
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使用与冻存时相同类型的培养基进行复苏可显著提高细胞回收率。
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如细胞系含有特定筛选标记（如 iNGN2 细胞系中的 G418），需在培养基中加入对应添加剂。
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抑制分化细胞生长
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可在培养基中加入 XAV939（起始终浓度 2 μM） 抑制分化细胞生长。
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可根据细胞生长情况上下调整剂量，但需确保 DMSO 总浓度 < 0.1%。
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细胞库建立建议
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在实验使用前，建议对每个细胞系建立冻存库。
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近乎融合的 10 cm 培养皿通常可制备约 9 支冻存管（每管 2 × 10⁶ 个细胞）。
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每支冻存管可良好复苏至 1 个 6 孔板孔。
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支原体检测
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SCBB 来源细胞均已通过支原体检测。
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若需再次检测，建议在独立培养体系中进行，并在检测前停用抗生素和 ROCK 抑制剂，以避免干扰检测灵敏度。
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